ADN RECOMBINANTE

 ADN recombinante- Agrobacterium tumefaciens

La bacteria Agrobacterium tumefaciens tiene la capacidad natural de transferir genes (ADN ) a las células de una planta que lo incorporan a su propio genoma y desarrollan un tumor que produce nutrientes para la bacteria. Es decir, el resultado de la interacción entre Agrobacterium y la planta es una planta que tiene células naturalmente recombinantes.(1)

EJEMPLO ADN RECOMBINANTE ARTIFICIAL

T: Generación y validación de virus de herpes simplex tipo 1 recombinantes (HSV-1) mediante disrupción genética CRISPR / Cas9

O: Desarrollo de vectores oncolíticos de HSV-1 y algunos protocolos de laboratorio comúnmente utilizados para caracterizar vectores de HSV-1 recombinantes y evaluar su actividad oncolítica in vitro

G: Gen de HSV1: 152 kb  (no especifica)

ER: enzima Cas9 (enzima endonucleasa)

EL: Ligasa T4, recombinasa Cre

V: Vector- fago BAC (no especifica)

CR: gen ICP6 de HSV1 (virus)

       eucariota (células de mamíferos)

MGT: Tranfección por choque térmico

MIC: Cultivo celular, CRIPR, PCR, secuenciación.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1.- https://www.pnas.org/content/98/2/485

2.-https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32122544/

TECNICAS DE HIBRIDACIÓN (Western Blot)- Cáncer de Cérvix

 TEMA: Las proteínas E6 / E7 son marcadores potenciales para la detección y el diagnóstico de lesiones precancerosas y cáncer de cuello uterino en una población china

Se recolectaron muestras de citología cervical y se congelaron para la extracción de proteínas agregando tampón de lisis celular rápida RIPA. Los extractos de proteínas totales (25 μg) se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio , de acuerdo con el peso molecular de las oncoproteínas E6 / E7 (17 kDa de HPV16) .Después de la electroforesis, las muestras se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon  y el anticuerpo monoclonal anti-VPH 16 (E7) y policlonal anti-VPH16 humano (E6) se incubaron con las membranas. Los anticuerpos primarios y secundarios contra GAPDH se mezclaron con soluciones de anticuerpos para las proteínas diana. Después de la incubación con los primarios, las membranas se incubaron  con los anticuerpos secundarios para la proteína E7 de HPV16 e IgG H&L para la proteína E6 de HPV16. 

NOTA: Las bandas de proteína en las membranas se detectaron usando un kit de quimioluminiscencia mejorada  y se expusieron a una película de rayos X . La extensión del valor de gris de las bandas de proteína se determinó usando un Densitómetro Personal SI y el análisis densitométrico se tomó usando el software ImageJ.

Figura 1. Se realizó un análisis densitométrico de las oncoproteínas del virus del papiloma humano (VPH) E6 / E7 en transferencias Western para cuantificar la positividad de la oncoproteína E6 / E7 en muestras citológicas cervicales utilizando un valor umbral positivo del 20% (proporción de E6 o E7 a gliceraldehído 3 -fosfato deshidrogenasa [GAPDH]). (A) Valor porcentual de E6 / GAPDH; (B) valor porcentual de E7 / GAPDH; (C) Análisis de transferencia Western de oncoproteínas E6 / E7 en muestras representativas con definición de expresión de proteínas (+ o -). 1-13: muestras de pacientes infectados por VPH, 14: muestra de control negativo de un voluntario san

REFERENCIA:

Shi, W., Liu, H., Wu, D., Tang, Z., Shen, Y., & Guo, L. (2017). E6/E7 proteins are potential markers for the screening and diagnosis of cervical pre‑cancerous lesions and cervical cancer in a Chinese population. Oncology Letters, 14, 6251-6258. https://www.spandidos-publications.com/10.3892/ol.2017.6932

PCR (Reacción en cadena de polimerasa)- Cáncer de Cérvix

 TEMA: Comparación de la detección y tipificación del virus del papiloma humano en muestras citológicas y de orina en pacientes del sexo femenino.

OBJETIVOS:  Identificar y detectar la presencia de VPH de alto riesgo en muestras

TIPO DE MUESTRA BIÓLOGICA: células exfoliadas de la región del endocérvix y muestras de orina

TIPO DE ÁCIDO NUCLÉICO: ADN viral mediante el estuche ADN-Kit Axygen Biosciences

GEN O SECUENCIA A AMPLIFICAR: amplificación de un fragmento del gen de la β-globina y de L1 del genoma viral

TIPO DE PCR: PCR en tiempo final y PCR multiplex.

VISUALIZACIÓN: Mediante EFO. (Fig 1).

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1.-Prado Y; Veitía D; Ferreiro M; Guglielmo,Z; Ávila M; Fernandes A; Correnti M. Comparación de la detección y tipificación del virus del papiloma humano en muestras citológicas y de orina en pacientes del sexo femenino. [Internet]. Investigación Clínica; Universidad del Zulia Maracaibo, Venezuela. 2, junio, 2017 [citado el 11 de julio 2021] vol. 58, núm, pp. 107-118. Disponible en: https://www.redalyc.org/pdf/3729/372951141002.pdf