ADN RECOMBINANTE

 ADN recombinante- Agrobacterium tumefaciens

La bacteria Agrobacterium tumefaciens tiene la capacidad natural de transferir genes (ADN ) a las células de una planta que lo incorporan a su propio genoma y desarrollan un tumor que produce nutrientes para la bacteria. Es decir, el resultado de la interacción entre Agrobacterium y la planta es una planta que tiene células naturalmente recombinantes.(1)

EJEMPLO ADN RECOMBINANTE ARTIFICIAL

T: Generación y validación de virus de herpes simplex tipo 1 recombinantes (HSV-1) mediante disrupción genética CRISPR / Cas9

O: Desarrollo de vectores oncolíticos de HSV-1 y algunos protocolos de laboratorio comúnmente utilizados para caracterizar vectores de HSV-1 recombinantes y evaluar su actividad oncolítica in vitro

G: Gen de HSV1: 152 kb  (no especifica)

ER: enzima Cas9 (enzima endonucleasa)

EL: Ligasa T4, recombinasa Cre

V: Vector- fago BAC (no especifica)

CR: gen ICP6 de HSV1 (virus)

       eucariota (células de mamíferos)

MGT: Tranfección por choque térmico

MIC: Cultivo celular, CRIPR, PCR, secuenciación.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1.- https://www.pnas.org/content/98/2/485

2.-https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32122544/

TECNICAS DE HIBRIDACIÓN (Western Blot)- Cáncer de Cérvix

 TEMA: Las proteínas E6 / E7 son marcadores potenciales para la detección y el diagnóstico de lesiones precancerosas y cáncer de cuello uterino en una población china

Se recolectaron muestras de citología cervical y se congelaron para la extracción de proteínas agregando tampón de lisis celular rápida RIPA. Los extractos de proteínas totales (25 μg) se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio , de acuerdo con el peso molecular de las oncoproteínas E6 / E7 (17 kDa de HPV16) .Después de la electroforesis, las muestras se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon  y el anticuerpo monoclonal anti-VPH 16 (E7) y policlonal anti-VPH16 humano (E6) se incubaron con las membranas. Los anticuerpos primarios y secundarios contra GAPDH se mezclaron con soluciones de anticuerpos para las proteínas diana. Después de la incubación con los primarios, las membranas se incubaron  con los anticuerpos secundarios para la proteína E7 de HPV16 e IgG H&L para la proteína E6 de HPV16. 

NOTA: Las bandas de proteína en las membranas se detectaron usando un kit de quimioluminiscencia mejorada  y se expusieron a una película de rayos X . La extensión del valor de gris de las bandas de proteína se determinó usando un Densitómetro Personal SI y el análisis densitométrico se tomó usando el software ImageJ.

Figura 1. Se realizó un análisis densitométrico de las oncoproteínas del virus del papiloma humano (VPH) E6 / E7 en transferencias Western para cuantificar la positividad de la oncoproteína E6 / E7 en muestras citológicas cervicales utilizando un valor umbral positivo del 20% (proporción de E6 o E7 a gliceraldehído 3 -fosfato deshidrogenasa [GAPDH]). (A) Valor porcentual de E6 / GAPDH; (B) valor porcentual de E7 / GAPDH; (C) Análisis de transferencia Western de oncoproteínas E6 / E7 en muestras representativas con definición de expresión de proteínas (+ o -). 1-13: muestras de pacientes infectados por VPH, 14: muestra de control negativo de un voluntario san

REFERENCIA:

Shi, W., Liu, H., Wu, D., Tang, Z., Shen, Y., & Guo, L. (2017). E6/E7 proteins are potential markers for the screening and diagnosis of cervical pre‑cancerous lesions and cervical cancer in a Chinese population. Oncology Letters, 14, 6251-6258. https://www.spandidos-publications.com/10.3892/ol.2017.6932

PCR (Reacción en cadena de polimerasa)- Cáncer de Cérvix

 TEMA: Comparación de la detección y tipificación del virus del papiloma humano en muestras citológicas y de orina en pacientes del sexo femenino.

OBJETIVOS:  Identificar y detectar la presencia de VPH de alto riesgo en muestras

TIPO DE MUESTRA BIÓLOGICA: células exfoliadas de la región del endocérvix y muestras de orina

TIPO DE ÁCIDO NUCLÉICO: ADN viral mediante el estuche ADN-Kit Axygen Biosciences

GEN O SECUENCIA A AMPLIFICAR: amplificación de un fragmento del gen de la β-globina y de L1 del genoma viral

TIPO DE PCR: PCR en tiempo final y PCR multiplex.

VISUALIZACIÓN: Mediante EFO. (Fig 1).

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1.-Prado Y; Veitía D; Ferreiro M; Guglielmo,Z; Ávila M; Fernandes A; Correnti M. Comparación de la detección y tipificación del virus del papiloma humano en muestras citológicas y de orina en pacientes del sexo femenino. [Internet]. Investigación Clínica; Universidad del Zulia Maracaibo, Venezuela. 2, junio, 2017 [citado el 11 de julio 2021] vol. 58, núm, pp. 107-118. Disponible en: https://www.redalyc.org/pdf/3729/372951141002.pdf

Alteraciones Epigenéticas en el Cáncer de Cérvix

 Los dos cambios epigenéticos más estudiados son la metilación del ADN, en este los genes supresores de tumores que pertenecen a casi todas las vías de funciones del cáncer han silenciado o disminuido su expresión debido a la hipermetilación anormal del promotor en cáncer cervical. Y por otro lado, la acetilación de histonas muestra que las histonas acetiltransferasas (HAT) y desacetilasas (HDAC) son dos enzimas, encargadas de regular la maquinaria transcripcional, controlando el estado de acetilación de las histonas, a la vez, que están implicadas en la proliferación, la diferenciación y la regulación del ciclo celular y como resultado de la desregulación de este estado de acetilación a nivel celular podría estar relacionada con el proceso carcinogénico. (1)

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1.-Oscanoa R. Firma epigenética del Cáncer Cervical asociada a un exceso de peso determinada mediante análisis bioinformático de metilación de regiones promotoras [Internet]. Perú, UPCH. 2020[Citado el 27 de junio de 2021]. Disponible en https://repositorio.upch.edu.pe/bitstream/handle/20.500.12866/8945/Firma_OscanoaAida_Rosa.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Alteraciones en la traducción en el Cáncer de Cérvix

Los genes L1 y L2 codifican las proteínas encargadas del ensamblaje de las partículas virales. Se ha demostrado que el promotor tardío, es iniciado de una forma independiente y de este modo, es activado solo cuando las células están creciendo en el tejido estratificado del hospedero. Una vez activado, el promotor tardío dirige la transcripción de un grupo heterogéneo de sitios de inicio que servirán para producir un grupo de transcriptos que facilitan la traducción de las proteínas L1 y L2. La activación de los promotores tardíos está acompañada por la aceleración de la replicación viral y por altos niveles de expresión de proteínas virales. Cuando el promotor tardío es activado; la expresión de los genes tiene lugar con lo que se codifican las proteínas estructurales L1 y L2 las que se unen para ensamblar la cápsida y formar el virión

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1.-García D. Reibán A.  Información y actitudes que tienen las estudiantes de quinto y sexto curso del colegio Abelardo Tamariz Crespo sobre el Virus Papiloma Humano durante el período octubre-marzo. Cuenca, 2016. [Internet]. Cuenca. 2016 [Citado el 27 de junio de 2021]. Disponible en: https://www.tesisenred.net/bitstream/handle/10803/4644/mtgs1de1.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Alteraciones en la transcripción del Cáncer de Cérvix

En la etapa tardía se produce la replicación del genoma viral. En este proceso de integración se produce una alteración del gen E2 que a su vez modula los dos genes virales asociados a carcinogénesis: el E6 y E7, los cuales se expresarían en forma desregulada induciendo la proliferación celular, disrupción del control del ciclo normal e inhibición de la apoptosis Cuando las células ya se encuentran diferenciadas migran desde la capa basal hasta el estrato espinoso. Se lleva a cabo el ensamblaje de los viriones exclusivamente en los queratinocitos ya diferenciados y ocurre así la replicación del ADN viral alcanzando hasta 1000 copias por célula. (1)

Referencias Bibliográficas:

Román C, Merchán M, Andrade D, Campoverde E, Guaillazaca L. Virus del papiloma Hu,ano, cáncer cervico uterino y modificciones epigenéticas [internet]. Universidad Católica de Cuenca, artículo de revisión bibliográfica. Revista Estudiantil CEUS, Vol 1, NO. 2, Año 2019, pp.15-22 Disponible en:https://ceus.ucacue.edu.ec/index.php/ceus/article/view/13/9 

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Alteraciones en la replicación del Cáncer de Cérvix

Las proteínas del VPH E1 y E2 poseen el control acerca del número de copias que se llevará a cabo, por lo tanto, son moléculas críticas en la replicación viral son E6 y E7, las cuales inactivan funcionalmente los productos de dos genes supresores de tumores muy importantes, el gen p53 y Rb, respectivamente.  Por  otro  lado,  las  proteínas  E5,  E6  y  E7  son  las encargadas de la proliferación y transformación celular. La infección de estas células produce una activación de la expresión en cascada de genes virales, causando la producción entre 20 a 100 copias del ADN viral por célula.(1)

REFERENCIAS

Román C, Merchán M, Andrade D, Campoverde E, Guaillazaca L. Virus del papiloma Hu,ano, cáncer cervico uterino y modificciones epigenéticas [internet]. Universidad Católica de Cuenca, artículo de revisión bibliográfica. Revista Estudiantil CEUS, Vol 1, NO. 2, Año 2019, pp.15-22 Disponible en:https://ceus.ucacue.edu.ec/index.php/ceus/article/view/13/9